Impact des tests sur la conception microfluidique : considérations relatives aux réactifs

Fabricants de dispositifs

Choisissez votre fabricant de dispositifs avec soin. C’est une chose de mouler par injection des milliards de couvercles de plaques d’interrupteur électriques, mais c’en est une autre de produire des millions de dispositifs aux propriétés dimensionnelles et chimiques constantes. Collaborez étroitement avec le fabricant pour vous assurer qu’il comprend que les mêmes matières premières doivent être utilisées dans son procédé dans le temps et qu’elles ne peuvent être modifiées sans un préavis suffisant et sans réaliser des tests de la fonctionnalité du dispositif modifié.
Un mouleur par injection avec lequel nous avons travaillé a décidé d’économiser de l’argent en réutilisant des déchets plastiques provenant de cycles antérieurs pour mouler de nouvelles pièces. Les nouvelles pièces étaient similaires, mais les anticorps ne parvenaient pas à les recouvrir.
Chez un autre mouleur, un étudiant qui travaillait pendant l’été a décidé d’accélérer le temps de cycle de moulage en pulvérisant un produit de revêtement anti-adhérent du commerce sur le moule. Cela a accéléré le processus de moulage, mais les pièces étaient inutilisables.

Réactifs critiques dans les tests

La plupart des tests utilisent deux réactifs critiques : un réactif capture l’analyte d’intérêt, et l’autre réactif produit un signal détectable à partir de ces analytes capturés uniquement. Ces réactifs sont construits à partir de trois types de molécules de base : les anticorps, les sondes et les aptamères. Par exemple, dans un test ELISA sandwich, les anticorps primaires et secondaires ciblent différents épitopes ou régions de l’analyte pour capturer la cible d’intérêt, puis détecter les étapes suivantes avec un lavage suffisant entre chaque étape. Dans les tests moléculaires, il s’agirait de sondes vers différentes régions de l’acide nucléique cible.
Les sondes de test moléculaire sont synthétisées. Cela offre des avantages significatifs en termes de cohérence et de coûts. Cependant, ce n’est pas le cas avec les anticorps. Ici, les points de départ sont généralement des espèces animales qui ont des propriétés phylogénétiques spécifiques comme les lapins, les souris et les rats, les chevaux, les chèvres, les moutons et même les chameaux. Les campagnes visant à augmenter les anticorps prennent de six mois à un an avant de pouvoir être analysées en vue d’une utilisation. Étant donné que de nombreux anticorps sont disponibles dans le commerce sur catalogue (OTS), leur utilisation peut raccourcir le délai. En contre-partie, les anticorps OTS sont plus chers que les anticorps fabriqués sur commande et la spécificité et la sensibilité des tests de plusieurs fournisseurs doivent être évalués. Par ailleurs, étant donné que les anticorps OTS sont fournis à plusieurs clients, les fournisseurs peuvent modifier les procédés selon les besoins et sans notification. Un approvisionnement continu en anticorps spécifiques au test peut être amélioré en exigeant que le fournisseur d’anticorps soit certifié (FDA, GMP, GLP) et accrédité (ISO, EMA, ICH) ou audité. Certains anticorps sur catalogue se sont avérés d’origine douteuse et poser la « question de l’audit » peut identifier cette source peu fiable d’une matière première critique.
Une fois que les réactifs candidats ont été identifiés, une analyse préliminaire des propriétés souhaitées de sensibilité et de réactivité croisée peut être effectuée sur une plateforme (telle qu’une plaque de microtitrage) autre que le dispositif microfluidique en cours de développement. Il est cependant obligatoire de faire le test final sur le dispositif lui-même. Les anticorps qui fonctionnaient parfaitement bien sur une plateforme peuvent ne pas fonctionner aussi bien sur une autre plateforme pour des raisons qui ne sont toujours pas connues.
Les réactifs de capture sont généralement immobilisés dans le dispositif pour faciliter la séparation de l’analyte lié et n’ayant pas réagi et des réactifs de détection. Le lavage des composants liés améliore la sensibilité et réduit la liaison non spécifique.

Revêtements

Les revêtements de surface DIV sont des couches minces qui sont durcies et/ou séchées pour modifier la fonctionnalité d’une surface. Ces revêtements peuvent être passifs (lorsqu’il n’y a pas de prétraitement de la surface à revêtir) ou actifs (lorsque la surface est modifiée chimiquement pour favoriser la liaison du réactif de capture). Il existe des milliers de types de revêtements différents, tous dépendants de l’objectif fonctionnel du dispositif : tension superficielle ou mouillabilité, liaison d’une molécule ou d’un groupe latéral, protection environnementale ou chimique, obtention de propriétés optiques, ou d’autres comme les antimousses, les fongicides et les bactéricides. Il s'agit par exemple des silanes (les plus courants, qui ont été utilisés pour dérivatiser le verre, le silicium et les plastiques), des hydrocarbures perfluorés (excellents pour les surfaces hydrophobes) et du glutaraldéhyde (ou autre réactif bifonctionnel). Ceux-ci peuvent ensuite être utilisés pour coupler des sondes ou des anticorps à la surface.

Les particules magnétiques induites ont également été utilisées comme surfaces pour l’immobilisation. Un grand avantage est qu’elles peuvent être enduites par lots, puis ajoutées au dispositif. Les particules magnétiques sont principalement utilisées pour un procédé de purification sur le dispositif : en l’absence d’un champ magnétique externe, les particules enduites peuvent réagir efficacement avec l’analyte et, après application d’un champ magnétique, peuvent purifier l’analyte capturé en lavant tout matériau non lié. Ce serait comme si les réactifs de capture avaient été immobilisés sur le dispositif.

Chimies de détection

La chimie de détection est au cœur du test de diagnostic. C’est un domaine de recherche en constante évolution. Chaque année, de nouvelles entreprises introduisent de nouvelles technologies et de nouvelles chimies de détection pour mesurer des quantités toujours plus petites d’analyte. Toute chimie de détection viable doit répondre aux exigences critiques de sensibilité, de spécificité et de linéarité ; en d’autres termes, une réponse fiable et cohérente proportionnelle à la quantité d’analyte cible sur sa plage clinique.
La spectrophotométrie repose sur la mesure de l’absorption ou de la réflectance de la lumière diffusée à travers une chambre sur le dispositif et le ou les réactifs de détection. Le défi pour ce mode de détection est que les dispositifs microfluidiques peuvent avoir des longueurs de parcours d’absorption de la lumière courtes de l'ordre du sub-millimètre ou nécessitent des orientations de chambre uniques pour augmenter les longueurs de parcours lisibles. Un exemple qui utilisait des longueurs de parcours courtes reposait sur un procédé exclusif impliquant un « anticorps » marqué à l’or comme réactif de détection et l’ajout d’une solution de sel d’argent réductrice pour générer des cristaux de métal argent qui absorbent efficacement la lumière.
La fluorescence est une autre méthode de détection optique où la lumière incidente est utilisée pour exciter les molécules fluorescentes fixées de manière covalente aux réactifs de détection. Le réactif de détection est excité par la longueur d’onde de la lumière incidente et émet de la lumière à une longueur d’onde plus longue. La lumière émise est directement proportionnelle à la quantité d’analyte capturée, mais la longueur d’onde d’excitation/émission et l’intensité de l’émission dépendent du fluorophore. En règle générale, les filtres passe-bande sont nécessaires pour s’assurer que seule la longueur d’onde d’émission atteint le capteur CMOS et non les longueurs d’onde d’excitation et l’autofluorescence.
La détection électronique et électrochimique repose sur la mesure de la génération ou de la consommation d’électrons. C’est la méthode la plus courante pour la surveillance de la glycémie. La détection électrochimique a également été utilisée, mais elle nécessite des circuits qui doivent être fabriqués dans le dispositif. La méthode impose également des contraintes supplémentaires sur la pureté du réactif pour être viable
La chimiluminescence est l’un des choix les plus populaires pour la chimie de détection car elle est extrêmement sensible. Bien qu’il existe deux types de base de chimiluminescence (incandescente et flash), la chimiluminescence incandescente domine l’industrie des DIV. La chimiluminescence incandescente repose sur un réactif de détection couplé à une enzyme qui agit sur un substrat pour générer un intermédiaire instable qui se désintègre progressivement avec l’émission de lumière. Le test nécessite l’ajout d’un ou plusieurs réactifs séparés au test pour générer la lumière : le réactif déclencheur est un mélange d’un peroxyde et de luminol qui doit être mélangé juste avant le contact avec l’ester d’acridinium car le mélange déclencheur est instable. Les approches par chimiluminescence se font au détriment d’une plus grande complexité fluidique par rapport à la fluorescence pour obtenir une sensibilité accrue.

Réactifs de traitement d’échantillons

Les réactifs de capture et de détection ne pourraient pas fonctionner en l’absence d’une gamme d’autres régents. Les tampons de revêtement, les tampons de test, les tampons de préparation d’échantillons et les tampons de neutralisation et de lavage jouent un rôle essentiel pour rendre le test fonctionnel. L’ajout de composés qui garantissent que le pH reste dans des plages fixes est une pratique courante. D’autres sels, ajoutés pour maintenir la force ionique à des niveaux fixes, aident à maintenir les protéines repliées dans leurs états naturels. Des concentrations de sel étroitement contrôlées sont obligatoires dans les essais moléculaires pour maintenir la stabilité des paires de sondes et d’hybrides cibles. Les deux sont chargées négativement et se repousseraient l’une l’autre en l’absence de concentrations élevées de sel.
Les détergents sont inclus pour améliorer la mouillabilité de surface et les caractéristiques d’écoulement, mais il faut veiller à maintenir un minimum de tension superficielle pour un fonctionnement efficace du contrôle des fluides dans les écoulements microfluidiques, en particulier pour les fluides actifs ou contrôlés. Certains scientifiques de développement sont fascinés par les tampons exotiques coûteux qui fonctionnent rarement mieux que les solutions salines tamponnées au phosphate (PBS) ordinaires. Les gestionnaires feraient bien de poser la question suivante : « Est-ce le seul tampon capable de répondre aux exigences requises ? » La simplification et la normalisation des tampons permettent d’économiser de l’argent.

Stockage et stabilité de tampons

Pour les produits au point de service et en vente libre, les tampons sont stockés à bord du dispositif microfluidique et éliminés après utilisation. Les réactifs doivent être stables pendant au moins six mois pour être commercialement viables, et cette durée de conservation est généralement prolongée à un an avec des données de stabilité supplémentaires. Les micro-organismes sont omniprésents dans l’environnement ; en l’absence de conservateurs, ils consommeront volontiers ces réactifs.
Des cocktails de conservateurs peuvent être nécessaires pour contrôler à la fois les bactéries et les champignons comme les levures et les moisissures. L’azoture de sodium est un agent bactériostatique efficace et peu coûteux. La lyophilisation soit dans le dispositif microfluidique, soit sous forme de comprimé à ajouter au dispositif, peut également être utilisée pour conserver les réactifs. Pour maintenir les réactifs lyophilisés dans l’état souhaité avant la réhydratation, il faut prendre soin d’exclure toute trace d’humidité du dispositif. Les films plastiques utilisés pour sceller les tranchées microfluidiques dans les tunnels sont étonnamment poreux à la vapeur d’eau, de sorte que des sacs en Mylar avec dessiccants peuvent être nécessaires. La lumière et l’oxygène peuvent également endommager les réactifs et des précautions doivent être prises pour les exclure.
La stabilité du réactif doit être démontrée par des études de stabilité menées de manière rigoureuse. Les études en temps réel peuvent être complétées par des études accélérées qui peuvent être utilisées pour prédire la durée de conservation. Des températures élevées sont utilisées pour accélérer les réactions qui provoquent la détérioration du réactif. De la documentation existe pour aider à extrapoler la stabilité des réactifs en raison des exigences d’expédition et d’entreposage à plus de 50 degrés C et des exigences de conservation à « température ambiante » ou dans un réfrigérateur à 4 degrés C. Veuillez noter que certaines juridictions réglementaires (comme le Japon) n’accepteront pas les études de stabilité accélérées et insisteront sur des données en temps réel.