Como os ensaios impactam o design microfluídico: considerações sobre reagentes
O primeiro componente a ser considerado ao projetar um sistema microfluídico é o próprio dispositivo.
Pode não ser óbvio, mas o material do dispositivo pode interagir quimicamente com os outros reagentes de uma maneira que pode ser prejudicial ao ensaio. Por exemplo, um dispositivo pode absorver um dos reagentes essenciais ao longo do tempo e torná-lo indisponível para uso no ensaio, ou produtos químicos de lixiviação que interferem no ensaio. Por outro lado, alguns dos reagentes usados nos ensaios podem atacar o próprio dispositivo: alguns reagentes de ativação quimioluminescente contêm agentes oxidantes como peróxidos e ácido nítrico e a autofluorescência é a ruína de qualquer sistema de detecção de fluorescência.
Fabricantes de dispositivos
Escolha com cuidado o fabricante do dispositivo. Uma coisa é moldar por injeção bilhões de tampas de placas de interruptores elétricos, mas outra é produzir milhões de dispositivos com propriedades químicas e dimensionais consistentes. Trabalhe em estreita colaboração com o fabricante para garantir que ele entenda que as mesmas matérias-primas devem ser usadas no processo ao longo do tempo e não podem ser alteradas sem aviso prévio e sem testes da funcionalidade do dispositivo alterado.
Um moldador por injeção com quem trabalhamos decidiu economizar dinheiro reutilizando alguns pedaços de plástico de execuções anteriores na moldagem de novas peças. As novas peças pareciam as mesmas, mas os anticorpos não as revestiam.
Em outro moldador, um estudante universitário que estava trabalhando no verão decidiu acelerar o tempo do ciclo de moldagem pulverizando um produto comercial antiaderente para fritura no molde. Isso acelerou o processo de moldagem, mas as peças se tornaram inutilizáveis.
Reagentes essenciais em ensaios
A maioria dos ensaios usa dois reagentes essenciais: um deles captura o analito de interesse, e o outro produz um sinal detectável apenas dos analitos capturados. Estes reagentes são construídos de três tipos de moléculas de base: anticorpos, sondas e aptâmeros. Por exemplo, em um sanduíche do ELISA, os anticorpos primários e secundários são direcionados a diferentes epítopos ou regiões do analito para capturar o alvo de interesse e, em seguida, detectar como etapas subsequentes com lavagem suficiente entre cada etapa. Em ensaios moleculares, essas sondas seriam de diferentes regiões do ácido nucleico-alvo.
As sondas de ensaios moleculares são sintetizadas. Isso proporciona consistência significativa e vantagens de custo. No entanto, isso não ocorre com os anticorpos. Aqui, os pontos de partida são geralmente espécies de animais com propriedades filogenéticas específicas que incluem coelhos, camundongos e ratos, cavalos, cabras, ovelhas e até camelos. As campanhas para levantar anticorpos levam de seis meses a um ano, antes de serem examinadas quanto ao uso. Como muitos anticorpos estão disponíveis comercialmente para uso imediato (OTS, off the shelf), seu uso pode encurtar o cronograma. A desvantagem é que os anticorpos OTS são mais caros do que os anticorpos feitos por encomenda e vários fornecedores devem ser avaliados quanto a especificidade e sensibilidade do teste. Além disso, uma vez que os anticorpos OTS são fornecidos para vários clientes, os fornecedores podem alterar os processos conforme necessário e sem notificação. Um fornecimento contínuo de anticorpos específicos para testes pode ser melhorado, exigindo que o fornecedor de anticorpos seja certificado (FDA, GMP, GLP) e credenciado (ISO, EMA, ICH) ou auditado. Alguns anticorpos de catálogo provaram ser de origem questionável e fazer a "pergunta de auditoria" pode descobrir essa fonte não confiável de uma matéria-prima essencial.
Uma vez identificados os reagentes candidatos, a triagem preliminar das propriedades desejadas de sensibilidade e reatividade cruzada pode ser feita em uma plataforma (como uma placa de microtitulação) diferente do dispositivo microfluídico em desenvolvimento. No entanto, é obrigatório fazer o teste final no próprio dispositivo. Os anticorpos que funcionaram perfeitamente bem em uma plataforma podem não funcionar tão bem em outra, por razões que ainda não são compreendidas.
Os reagentes de captura são geralmente imobilizados no dispositivo para facilitar a separação do analito ligado e não reagido e dos reagentes de detecção. A lavagem dos componentes ligados aumenta a sensibilidade e reduz a ligação não específica.
Revestimentos
Os revestimentos de superfície IVD são camadas finas que são curadas e/ou secas para alterar a funcionalidade de uma superfície. Esses revestimentos podem ser passivos (onde não há pré-tratamento da superfície a ser revestida) ou ativos (onde a superfície é quimicamente modificada para incentivar a ligação do reagente de captura). Existem milhares de tipos diferentes de revestimentos, todos dependentes do objetivo funcional do dispositivo: tensão superficial ou molhabilidade, ligação de uma molécula ou grupo lateral, proteção ambiental ou química, obtenção de propriedades ópticas ou outras como antiespumantes, fungicidas e bactericidas. Os exemplos incluem silanos (os mais comuns, e têm sido usados para derivatizar vidro, silício e plásticos), perfluorocarbonos (excelentes para superfícies hidrofóbicas) e glutaraldeído (ou outro reagente bifuncional). Eles podem então ser usados para acoplar sondas ou anticorpos à superfície.
Partículas magnéticas induzidas também foram usadas como superfícies para imobilização. Uma grande vantagem é que podem ser revestidas em um processo de lote e, em seguida, adicionadas ao dispositivo. As partículas magnéticas são predominantemente usadas para um processo de purificação no dispositivo: na ausência de um campo magnético externo, as partículas revestidas podem reagir eficientemente com o analito e, após a aplicação de um campo magnético, podem purificar o analito capturado lavando qualquer material não ligado. Seria como se os reagentes de captura tivessem sido imobilizados no dispositivo.
Químicas de detecção
A química de detecção é o cerne do teste diagnóstico. É uma área de pesquisa que está em constante mudança. A cada ano, novas empresas introduzem novas tecnologias e novas químicas de detecção para medir quantidades cada vez menores de analito. Qualquer química de detecção viável deve ter os requisitos essenciais de sensibilidade, especificidade e linearidade; em outras palavras, uma resposta confiável e consistente que seja proporcional à quantidade de analito alvo em relação à variação clínica.
A espectrofotometria depende da medição da absorção ou refletância da luz que brilhou através de uma câmara no dispositivo e no(s) reagente(s) de detecção. O desafio nesse modo de detecção é que os dispositivos microfluídicos podem ter curtos comprimentos de trajetória de submilímetros na absorção da luz ou exigir orientações de câmara exclusivas para aumentar os comprimentos de trajetória legíveis. Um exemplo que usou comprimentos de trajetória curtos foi baseado em um processo exclusivo, envolvendo um "anticorpo" rotulado em ouro como reagente de detecção e adicionando uma solução redutora de sal de prata para gerar cristais de metal prateado que absorvem a luz eficientemente.
Fluorescência é outro método de detecção óptica, em que a luz incidente é usada para excitar moléculas fluorescentes covalentemente ligadas aos reagentes de detecção. O reagente de detecção é estimulado pelo comprimento de onda da luz incidente e emite a luz em um comprimento de onda mais longo. A luz emitida é diretamente proporcional à quantidade de analito capturado, mas o comprimento de onda de estimulação/emissão e a intensidade da emissão são dependentes de fluoróforos. Normalmente, os filtros de passagem de banda são exigidos para garantir que apenas o comprimento de onda da emissão atinja o sensor CMOS, e não os comprimentos de onda de estimulação e fluorescência automática.
A detecção eletrônica e eletroquímica depende da medição da geração ou consumo de elétrons. Esse é o método mais comum para monitoramento da glicose. A detecção eletroquímica também foi usada, mas requer circuitos que devem ser fabricados no dispositivo. O método também impõe certas restrições adicionais à pureza do reagente para ser viável
Quimioluminescência é uma das escolhas mais populares para a química de detecção, por ser extremamente sensível. Embora existam dois tipos básicos de quimioluminescência (brilho e flash), a de brilho domina o setor de IVD. A quimioluminescência de brilho depende de um reagente de detecção acoplado a uma enzima, que atua em um substrato para gerar um intermediário instável que decai gradualmente com a emissão de luz. O ensaio requer a adição de um ou mais reagentes separados ao ensaio para gerar a luz: o reagente desencadeador é uma mistura de peróxido e luminol que deve ser misturado pouco antes do contato com o éster de acridínio, pois a mistura de desencadeamento é instável. As abordagens de quimioluminescência têm um custo de maior complexidade fluídica em relação à fluorescência para obter maior sensibilidade.
Reagentes de processamento de amostras
Os reagentes de captura e detecção não poderiam funcionar na ausência de vários outros regentes. Tampões de revestimento, de ensaio, de preparação de amostras e de neutralização e lavagem cumprem funções essenciais para tornar o ensaio funcional. A adição de compostos que garantem que o pH permaneça em faixas fixas é uma prática comum. Outros sais, adicionados para manter a força iônica em níveis fixos, ajudam a manter as proteínas dobradas em seus estados naturais. Concentrações de sal rigorosamente controladas são obrigatórias nos ensaios moleculares para manter os pares híbridos de sonda e alvo estáveis. Ambos são carregados negativamente e se repeliriam na ausência de altas concentrações de sal.
Detergentes são incluídos para melhorar as características de molhabilidade e fluxo da superfície, mas deve-se tomar cuidado para manter um mínimo de tensão superficial para uma operação eficiente de controle de fluido nos fluxos microfluídicos, especialmente para fluidos ativos ou controlados. Alguns cientistas de desenvolvimento têm um fascínio por tampões exóticos caros, que raramente funcionam melhor do que as soluções salinas tamponadas com fosfato (PBS) comuns. Seria bom se os gerentes perguntassem: "Este é o único tampão que pode atender ao requisito necessário?" A simplificação e a padronização do tampão economizam dinheiro.
Armazenamento e estabilidade do tampão
Para produtos de ponto de atendimento e de venda livre, os tampões são armazenados a bordo do dispositivo microfluídico e descartados após o uso. Os reagentes precisam ser estáveis por pelo menos seis meses para serem comercialmente viáveis, e esse prazo de validade normalmente é estendido para um ano com dados de estabilidade adicionais. Os microrganismos são onipresentes no meio ambiente; na ausência de conservantes, eles consumirão alegremente esses reagentes.
Coquetéis de conservantes podem ser necessários para controlar bactérias e fungos como leveduras e mofos. A azida de sódio é um bacteriostato efetivo e barato. A liofilização no dispositivo microfluídico ou como um comprimido a ser adicionado ao dispositivo também pode ser usada para preservar os reagentes. Para manter os reagentes liofilizados no estado desejado antes da reidratação, deve-se tomar cuidado para excluir a umidade do dispositivo. Os filmes plásticos usados para vedar trincheiras microfluídicas em túneis são surpreendentemente porosos ao vapor de água, de modo que sacos de Mylar com dessecantes podem ser necessários. A luz e o oxigênio também podem danificar os reagentes e deve-se tomar cuidados para excluí-los.
A estabilidade do reagente deve ser demonstrada com estudos de estabilidade rigorosamente realizados. Estudos em tempo real podem ser complementados com estudos acelerados que podem ser usados para prever a vida útil. Temperaturas elevadas são empregadas para acelerar as reações que causam a deterioração do reagente. Existe literatura para ajudar a extrapolar a estabilidade do reagente devido aos requisitos de transporte e armazenamento acima de 50 graus C e requisitos de prateleira em "temperatura ambiente" ou em geladeira a 4 graus C. Observe que algumas jurisdições regulatórias (como o Japão) não aceitam estudos de estabilidade acelerados e insistem em dados em tempo real.
