Cómo los ensayos impactan el diseño de microfluidos: consideraciones sobre los reactivos
El primer componente para considerar al diseñar un sistema de microfluidos es el propio dispositivo.
Puede que no sea obvio, pero el material del dispositivo puede interactuar químicamente con los otros reactivos de una manera que puede ser perjudicial para el ensayo. Por ejemplo, un dispositivo puede absorber uno de los reactivos críticos con el tiempo y hacer que no esté disponible para ser utilizado en el ensayo, o lixiviar productos químicos que interfieren con el ensayo. Por el contrario, algunos de los reactivos utilizados en los ensayos pueden atacar el dispositivo en sí: algunos reactivos desencadenantes quimioluminiscentes contienen agentes oxidantes como peróxidos y ácido nítrico y la autofluorescencia es la pesadilla de cualquier sistema de detección de fluorescencia.
Fabricantes de dispositivos
Elige cuidadosamente el fabricante de tu dispositivo. Una cosa es moldear por inyección miles de millones de cubiertas de placas de interruptores eléctricos, pero otra es producir millones de dispositivos con propiedades dimensionales y químicas coherentes. Trabaja en estrecha colaboración con el fabricante para asegurarte de que entiende que se deben utilizar las mismas materias primas en su proceso a lo largo del tiempo y no se pueden cambiar sin previo aviso y prueba de la funcionalidad del dispositivo alterado.
Un moldeador de inyección con el que trabajamos decidió ahorrar dinero reutilizando algunos desechos de plástico de tiradas anteriores en el moldeado de piezas nuevas. Las nuevas partes se veían iguales, pero los anticuerpos no las cubrían.
En otro moldeador, un estudiante universitario que estaba trabajando durante el verano decidió acelerar el tiempo del ciclo de moldeado rociando un producto comercial antiadherente para freír en el molde. Aceleró el proceso de moldeado, pero las piezas eran inutilizables.
Reactivos críticos en ensayos
La mayoría de los ensayos utilizan dos reactivos críticos: un reactivo captura el analito de interés, y el otro reactivo produce una señal detectable solo de los analitos capturados. Estos reactivos se construyen a partir de tres tipos de moléculas base: anticuerpos, sondas y aptámeros. Por ejemplo, en un ELISA “sándwich”, los anticuerpos primarios y secundarios se dirigen a diferentes epítopos o regiones del analito para capturar el objetivo de interés y luego detectar como pasos posteriores con suficiente lavado entre cada paso. En ensayos moleculares, estos serían sondas a diferentes regiones del ácido nucleico objetivo.
Se sintetizan sondas de ensayo molecular. Esto proporciona una consistencia significativa y ventajas de costos. Sin embargo, este no es el caso con los anticuerpos. Aquí, los puntos de partida suelen ser especies animales que tienen propiedades filogenéticas específicas que incluyen conejos, ratones y ratas, caballos, cabras, ovejas e incluso camellos. Las campañas para aumentar los anticuerpos tardan de seis meses a un año antes de que puedan ser examinados para su uso. Dado que muchos anticuerpos están disponibles comercialmente listos para usar (OTS), usarlos puede acortar el tiempo. La desventaja es que los anticuerpos OTS son más caros que los anticuerpos hechos a pedido y se debe evaluar la especificidad y sensibilidad de múltiples proveedores. Además, dado que los anticuerpos OTS se proporcionan para múltiples clientes, los proveedores pueden cambiar los procesos según sea necesario y sin notificación. Se puede mejorar un suministro continuo de anticuerpos específicos de la prueba exigiendo que el proveedor de anticuerpos esté certificado (FDA, GMP, GLP) y acreditado (ISO, EMA, ICH) o auditado. Algunos anticuerpos de catálogo han demostrado ser de origen cuestionable y hacer la “pregunta de auditoría” puede descubrir esta fuente poco confiable de una materia prima crítica.
Una vez que se han identificado los reactivos candidatos, se puede realizar una selección preliminar de las propiedades deseadas de sensibilidad y reactividad cruzada en una plataforma (como una placa de microtitulación) que no sea el dispositivo de microfluidos en desarrollo. Sin embargo, es obligatorio hacer la prueba final en el propio dispositivo. Los anticuerpos que funcionaron perfectamente bien en una plataforma pueden no funcionar tan bien en otra plataforma por razones que aún no se entienden.
Los reactivos de captura generalmente se inmovilizan en el dispositivo para facilitar la separación de los reactivos de analito y detección unidos y no reaccionados. El lavado de los componentes unidos mejora la sensibilidad y reduce la unión no específica.
Recubrimientos
Los recubrimientos superficiales de IVD son capas delgadas que se curan o secan para cambiar la funcionalidad de una superficie. Estos recubrimientos pueden ser pasivos (donde no hay pretratamiento de la superficie a recubrir) o pueden ser activos (donde la superficie se modifica químicamente para fomentar la unión del reactivo de captura). Existen miles de tipos diferentes de recubrimientos, todos dependientes del objetivo funcional del dispositivo: tensión superficial o humectabilidad, unión de una molécula o grupo lateral, protección ambiental o química, logro de propiedades ópticas, u otros como antiespumantes, fungicidas y bactericidas. Los ejemplos incluyen silanos (los más comunes y se han utilizado para derivar vidrio, silicio y plásticos), perfluorocarbonos (excelentes para superficies hidrófobas) y glutaraldehído (u otro reactivo bifuncional). Estos se pueden usar para acoplar sondas o anticuerpos a la superficie.
Las partículas magnéticas inducidas también se han utilizado como superficies para la inmovilización. Una gran ventaja es que pueden recubrirse en un proceso por lotes y luego agregarse al dispositivo. Las partículas magnéticas se utilizan predominantemente para un proceso de purificación en el dispositivo: en ausencia de un campo magnético externo, las partículas recubiertas pueden reaccionar eficientemente con el analito y, después de la aplicación de un campo magnético, pueden purificar el analito capturado lavando cualquier material no unido. Esto sería como si los reactivos de captura hubieran sido inmovilizados en el dispositivo.
Química de detección
La química de detección es el corazón de la prueba de diagnóstico. Es un área de investigación que cambia constantemente. Cada año, nuevas empresas introducen nuevas tecnologías y nuevas químicas de detección para medir cantidades cada vez más pequeñas de analito. Cualquier química de detección viable debe tener los requisitos críticos de sensibilidad, especificidad y linealidad; en otras palabras, una respuesta fiable y coherente que sea proporcional a la cantidad de analito objetivo en su rango clínico.
La espectrofotometría se basa en medir la absorción o reflectancia de la luz que brilla a través de una cámara en el dispositivo y el reactivo de detección (o reactivos). El desafío para este modo de detección es que los dispositivos de microfluidos pueden tener longitudes cortas de absorción de luz de submilímetros o requieren orientaciones de cámara únicas para aumentar las longitudes de las rutas legibles. Un ejemplo que utilizó trayectorias cortas se basó en un proceso que involucraba un “anticuerpo” marcado con oro como reactivo de detección y la adición de una solución de sal de plata reductora para generar cristales de metal plateado que absorben la luz de manera eficiente.
La fluorescencia es otro método de detección óptica donde la luz incidente se utiliza para estimular moléculas fluorescentes unidas covalentemente a los reactivos de detección. El reactivo de detección se excita por la longitud de onda de la luz incidente y emite luz a una longitud de onda más larga. La luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de analito capturado, pero la longitud de onda de excitación/emisión y la intensidad de emisión dependen del fluoróforo. Por lo general, se requieren filtros de paso de banda para garantizar que solo la longitud de onda de emisión llegue al sensor CMOS y no las longitudes de onda de excitación y la autofluorescencia.
La detección electrónica y electroquímica se basa en medir la generación o el consumo de electrones. Este es el método más común para el monitoreo de glucosa. También se ha utilizado la detección electroquímica, pero requiere circuitos que deben fabricarse en el dispositivo. El método también impone algunas restricciones adicionales a la pureza del reactivo para ser viable
La quimioluminiscencia es una de las opciones más populares para la química de detección porque es extremadamente sensible. Si bien hay dos tipos básicos de quimioluminiscencia (resplandor y destello), la quimioluminiscencia luminosa domina la industria de IVD. La quimioluminiscencia luminosa se basa en un reactivo de detección acoplado a enzimas que actúa sobre un sustrato para generar un intermediario inestable que decae gradualmente con la emisión de luz. El ensayo requiere la adición de un reactivo separado (o reactivos) al ensayo para generar la luz: el reactivo accionador es una mezcla de un peróxido y luminol que debe mezclarse justo antes del contacto con el éster de acridinio, ya que la mezcla accionadora es inestable. Los enfoques de quimioluminiscencia tienen un costo de mayor complejidad fluídica sobre la fluorescencia para lograr una mayor sensibilidad.
Reactivos de procesamiento de muestras
Los reactivos de captura y detección no podían funcionar en ausencia de una variedad de otros regentes. Los tampones de recubrimiento, los tampones de ensayo, los tampones de preparación de muestras y los tampones de neutralización y lavado desempeñan un papel fundamental para hacer que el ensayo sea funcional. Agregar compuestos que aseguren que el pH permanezca en rangos fijos es una práctica común. Otras sales, agregadas para mantener la fuerza iónica en niveles fijos, ayudan a mantener las proteínas plegadas en sus estados naturales. Las concentraciones de sal estrictamente controladas son obligatorias en los ensayos moleculares para mantener estables los pares híbridos de sonda y objetivo. Ambos están cargados negativamente y se repelerían mutuamente en ausencia de altas concentraciones de sal.
Se incluyen detergentes para mejorar la humectabilidad de la superficie y las características del flujo, pero se debe tener cuidado de mantener un mínimo de tensión superficial para una operación eficiente del control de fluidos en los flujos de microfluidos, especialmente para fluidos activos o controlados. Algunos científicos del desarrollo tienen una fascinación por los costosos tampones exóticos que rara vez funcionan mejor que las soluciones salinas tamponadas con fosfato (PBS) ordinarias. Los gerentes harían bien en hacer la pregunta: “¿Es este el único tampón que puede cumplir con el requisito necesario?” La simplificación y estandarización del tampón ahorra dinero.
Estabilidad y almacenamiento de tampón
Para los productos de venta libre y de análisis de diagnóstico inmediato, los tampones se almacenan a bordo del dispositivo de microfluidos y se desechan después de su uso. Los reactivos deben ser estables durante al menos seis meses para ser comercialmente viables, y esa vida útil generalmente se extiende a un año con datos de estabilidad adicionales. Los microorganismos son omnipresentes en el medioambiente; en ausencia de conservantes, consumirán felizmente estos reactivos.
Los cócteles de conservantes pueden ser necesarios para controlar tanto las bacterias como los hongos como las levaduras y los mohos. La azida de sodio es un bacteriostato eficaz y económico. La liofilización, ya sea en el dispositivo de microfluidos o como una tableta que se agregará al dispositivo, también se puede usar para preservar los reactivos. Para mantener los reactivos liofilizados en su estado deseado antes de la rehidratación, se debe tener cuidado de excluir la humedad del dispositivo. Las películas de plástico utilizadas para sellar zanjas microfluídicas en túneles son sorprendentemente porosas al vapor de agua, por lo que pueden ser necesarias bolsas de Mylar con desecantes. La luz y el oxígeno también pueden dañar los reactivos y se debe tener cuidado para excluirlos.
La estabilidad del reactivo debe demostrarse con estudios de estabilidad rigurosamente realizados. Los estudios en tiempo real se pueden complementar con estudios acelerados que se pueden utilizar para predecir la vida útil. Las temperaturas elevadas se emplean para acelerar las reacciones que causan el deterioro del reactivo. Existe literatura para ayudar a extrapolar la estabilidad de los reactivos debido a los requisitos de envío y almacenamiento con más de 50 °C, y los requisitos de almacenamiento a “temperatura ambiente” o en un refrigerador a 4 °C. Ten en cuenta que algunas jurisdicciones reguladoras (como Japón) no aceptarán estudios de estabilidad acelerados e insistirán en datos en tiempo real.
